EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（647）

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EdU-647細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒

原理：EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見(jiàn)，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠替代胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine) 插入正在復(fù)制的DNA分子中， EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488等)通過(guò)一價(jià)銅離子催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)，從而可以進(jìn)行高效快速的檢測(cè)細(xì)胞增殖，特別是可以有效地檢測(cè)處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法相比， EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，不需要嚴(yán)格的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測(cè)細(xì)胞增殖的真實(shí)情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測(cè)速度。

產(chǎn)品貨號(hào)：RCF-042

規(guī)格：200T

有效期：12個(gè)月

試劑盒組成

備注：AC為粉劑，使用之前需要加入1mL純水，充分溶解之后再使用，AC容易氧化失效，不使用時(shí)放入冰箱-20度保存，如發(fā)現(xiàn)變色，需更換新鮮試劑。

實(shí)驗(yàn)流程

1.樣本處理

1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1動(dòng)物EdU注射

對(duì)于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。

注射方式:依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔注射為多。

6小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)候也可參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。

建議任何實(shí)驗(yàn)均可取小腸組織檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，小腸上皮組織細(xì)胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小時(shí)后即可檢測(cè)到陽(yáng)性信息，可用作陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2切片處理

切片前處理：組織器官最好進(jìn)行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

切片厚度：3-10μm為宜，切片過(guò)厚可能會(huì)影響切片背景及染色效率。

切片后處理：

石蠟切片脫蠟：二甲苯脫蠟2次，15分鐘/次，梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）各一次，5分鐘/次，去離子水洗脫1次。

冰凍切片處理：室溫放置30分鐘后，固定10分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1細(xì)胞EdU標(biāo)記

用細(xì)胞完全培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基；

每孔加入適量50μM的EdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基（最佳孵育時(shí)間一般為細(xì)胞周期的1/10）,EdU培養(yǎng)基和EdU反應(yīng)液孵育體積可參考下表；

3）PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘

1.2.2細(xì)胞固定通透

1）每孔加入細(xì)胞固定液（含4%的多聚甲醛的PBS）室溫孵育15分鐘，棄固定液，PBS 清洗3次，每次5 分鐘。；

2）每孔加入滲透劑(0.5% TritonX-100 的 PBS)脫色搖床孵育 15 分鐘；PBS 清洗3次，每次5 分鐘。

2.EdU反應(yīng)

按照PB：CU：AC：647色原=860：40：100：5的比列配制EdU反應(yīng)液（反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用）。

每個(gè)樣本滴加50-100μL的EdU染色反應(yīng)液（反應(yīng)液均勻覆蓋樣本），室溫避光孵育15-60分鐘，棄染色反應(yīng)液，PBS沖洗3次，每次5分鐘。

3.DAPI染色

每個(gè)樣本加入50-100μL DAPI染色液，染色15分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

4.圖像拍照

染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者全片掃描儀進(jìn)行采集圖像，染色完玻片避光4℃保存。

以上是50mg/kg標(biāo)記小鼠6小時(shí)的染色圖像

實(shí)驗(yàn)前須知

EdU 的分子量為 252.23，易溶于水，PBS，生理鹽水。

對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建議將EdU粉末溶解于DMSO配制成100mg/ml的母液。

EdU 建議初始給藥量為 50mg/kg（50μg/g），稀釋濃度為 0.5~1mg/mL。小鼠體重20g，需要注射1mg，以1mg/mL計(jì)算，需要注射1mL。

對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)， EdU母液質(zhì)量濃度為100mg/mL，轉(zhuǎn)化為物質(zhì)的量濃度為400mM，建議將EdU母液稀釋成50mM儲(chǔ)存液，推薦的EdU工作濃度為10μM。

文章引用試劑盒/方法：Staining of EdU was performed using a EdU cell proliferation Assay kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the click chemistry technology according to the manufacture’s instruction.