七色多重免疫熒光經(jīng)常遇到的一些問題以及最新版流程

FAQ（經(jīng)常問到的一些問題）：

1. 問：為什么會串色？

   答：串色與多種因素有關(guān)系：A 可能與成像設備濾光片帶寬有關(guān)系，盡量選用窄波長帶寬的濾光片；B 可能與上一輪抗體未被完全洗脫關(guān)系，對于一些親和力比較高的抗體比如CK等，抗體洗脫條件需要延長（提高洗脫溫度 時間等）；C 可能與信號不平衡有關(guān)系，比如相鄰兩個通道染料，一個強度過高，一個過低，導致強的信號發(fā)生外溢；D其他可能存在的原因，比如抗體弄混，下一輪抗體忘記洗脫/修復等。

2. 問：TYR-xxxPlus熒光染料與TSA buffer稀釋比例怎樣優(yōu)化？

答：本試劑盒靈敏度比較高，是常規(guī)TSA試劑盒的10-50倍，注意信號不要過強；信號過強 則降低染料濃度/反應時間/一抗?jié)舛龋盘栠^低 提高染料濃度/反應時間/一抗?jié)舛龋槐驹噭┖械奶攸c，濃度越高，將成指數(shù)倍增強信號；1:50能獲得最強信號，1:500相當于常規(guī)TSA信號。

3. 問：抗原修復方式/抗體洗脫方式怎么選擇？

答：建議第一輪抗原修復9.0 EDTA,95度15-25min；第二輪或以上抗體洗脫/抗原修復，建議檸檬酸6.0   95度25min-40min，針對一些容易掉片的組織，抗體洗脫可以采用抗體洗脫液（我司有賣：mIHC專用抗體洗脫液），抗體洗脫液時間過長可能會導致抗原識別降低/dapi核弱染，注意把控抗體洗脫液時間（一般室溫或者37度5-15min，1-2次能到到比較理想的結(jié)果）。

4. 問：染料是否需要避光？

答：本試劑盒熒光染料抗淬滅性強，全程無需日光燈下避光，使用過程中也無需在暗環(huán)境中操作，但不能在太陽光下照射。

5. 問：做多標時，指標/抗體順序如何選擇？

答：難以洗脫的抗體，擺在最后一輪，不然容易串色，比較難做的指標放在前面幾輪做（比如foxp3），第一輪通常做適合EDTA 9.0修復的指標；根據(jù)我司經(jīng)驗，第一輪通常采用EDTA 9.0/高壓6.0 第二輪及其以上通常采用6.0，多抗建議6.0 。

6. 問：為什么有時候有非特異性或者非特異是怎么產(chǎn)生的以及怎樣改善？

答：非特異的產(chǎn)生有幾種可能，A：抗體是多克隆的，容易產(chǎn)生非特異，可以換用單克隆抗體或者降低濃度以及修復強度來改善；B:信號放大過強，可以降低染液反應時間或者濃度；C：一抗?jié)舛冗^高或者修復過度，采用比較低的稀釋抗體比例，或降低修復強度（溫度或者時間或者修復液PH）。

7. 問：做石蠟切片mIHC,抗體應該怎樣選擇？

答：盡量選用單克隆抗體，抗體應用選用IHC /mIHC/ IHC-P,優(yōu)先選用經(jīng)過敲除驗證的抗體等。

8. 問：本試劑盒對于其他進口/國產(chǎn)試劑盒優(yōu)勢在哪里？

   答：A：超高的性價比，其他品牌試劑盒動輒過萬，我司試劑盒價格在2k-1w之間；B 穩(wěn)定性好：即使試劑盒不小心被放在常溫，也能在一個月的放置后，可以繼續(xù)使用 以及檢測信號靈敏度無差異，茹創(chuàng)生物開發(fā)的此款試劑盒，采用了最新配方，有各種保護劑 防腐劑 H2O2穩(wěn)定劑等成分，極大提高了試劑盒穩(wěn)定性；C 超高靈敏度：最高靈敏度可以達到市場其他公司的10-50倍。

七色多重熒光染色試劑盒Plus（六標七色）

原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法   ，TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色”步驟（HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體洗脫液洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480Plus，TYR-520Plus，TYR-570Plus，TYR-620Plus，TYR-690Plus，TYR-780Plus。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現(xiàn)單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

試劑盒規(guī)格：100T

試劑盒貨號：RC0086Plus-67RM

儲存溫度：4度，一年有效

試劑盒組成：

染料使用方法：TSA熒光染料反應液 =TYR-xxxPlus 熒光染料+TSA buffer；TYR-xxxPlus 熒光染料：TSA buffer=1：200；TYR-xxxPlus 熒光染料與TSA buffer的稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，最佳范圍為1:50--1:400(1:200大部分情況能得到最佳結(jié)果）；一般建議若一抗孵育時間常溫1h-3h內(nèi)，建議稀釋比例1:50-1:200, 若一抗孵育時間4度過夜（12h或以上），建議稀釋比例1:200-1:400或更高。

操作流程簡圖：

詳細操作步驟

1、樣本準備：

1）石蠟切片：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸餾水洗。

2）冰凍切片：冰凍切片固定10-30min，PBS洗5min，重復3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復3次。

3）細胞爬片或者細胞涂片：細胞樣本固定10-30min，PBS洗5min重復3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復3次。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復（也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復方法）。中火8min，?；?/span>8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定，冰凍切片和細胞樣本可省略此步驟）。

3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、非特異性靶點封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用抗體稀釋液（或者其他封閉液 3%BSA 或者山羊血清）均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。額外說明：抗體稀釋液內(nèi)含有各種保護劑以及防腐劑，可以用來封閉或者稀釋一抗，稀釋后的一抗可以長期四度保存（在常溫下也可以保存一個月之久）

5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）；

6、加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。額外說明：本試劑盒內(nèi)自帶的hrp山羊抗兔/鼠通用二抗為即用型，具有超高靈敏度，隨時可用，無需配置。

7、TSA熒光染料反應液反應：濃縮型熒光染料與TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均勻，切片滴加配好的TSA熒光染料反應液均勻覆蓋組織室溫反應1-15min（最佳時間5min-10min），PBS洗三次（預實驗可先染1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續(xù)滴加熒光染料加強染色強度直至合適強度后繼續(xù)進行下一步）。

8、抗體洗脫：石蠟切片置于抗原修復液中95度水浴25-40min（根據(jù)不同抗體親和力 靈活調(diào)整時間）或者滴加適量37度預熱至完全溶解的mIHC專用抗體洗脫液（冰凍切片爬片骨組織建議用）覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘（石蠟切片可用熱修復洗脫或者抗體洗脫液洗脫，細胞及冰切切片需用抗體洗脫液進行洗脫）

9、 重復3-8步驟（換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料）---第二輪標記

10、重復3-8步驟（換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料）---第三輪標記

11、重復3-8步驟（換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料）---第四輪標記

12、重復3-8步驟（換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料）---第五輪標記

13、重復3-7步驟（換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料）---第六輪標記

14、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI即用型染液，避光室溫孵育5min-20min。

15、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片（我司有相應產(chǎn)品）。

16、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Seven color mIHC Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

近年用茹創(chuàng)試劑盒發(fā)表的文章：

1.Zhang Hao,Wang Yifan,Zhao Yihan et al. PTX3 mediates the infiltration, migration, and inflammation-resolving-polarization of macrophages in glioblastoma.[J] .CNS Neurosci Ther, 2022, 28: 1748-1766.

2.Qin Zhen,Wang Peng-Yuan,Wan Jing-Jing et al. MicroRNA124-IL6R Mediates the Effect of Nicotine in Inflammatory Bowel Disease by Shifting Th1/Th2 Balance Toward Th1.[J] .Front Immunol, 2020, 11: 235.

3.Su Ruopeng,Chen Lei,Jiang Zhou et al. Comprehensive analysis of androgen receptor status in prostate cancer with neuroendocrine differentiation.[J] .Front Oncol, 2022, 12: 955166.

4.Lin Ka-Na,Zhang Kan,Zhao Wei et al. Insulin-like Growth Factor 1 Promotes Cell Proliferation by Downregulation of G-Protein-Coupled Receptor 17 Expression via PI3K/Akt/FoxO1 Signaling in SK-N-SH Cells.[J] .Int J Mol Sci, 2022, 23: undefined.