細胞爬片、冰凍切片、骨組織 TSA多色免疫熒光方法來啦

原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法   ，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色”步驟（HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合，使樣品上穩(wěn)定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點)，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩(wěn)定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現(xiàn)單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

試劑盒規(guī)格：100T

試劑盒組成：

備注：TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍，抗體洗脫液使用前37度預熱至完全溶解。

TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

操作流程：

1、 冰凍切片準備：冰箱取出冰凍切片恢復至室溫晾干水分后固定10-30min，PBS洗5min重復3次。

2、 切片破膜：滴加破膜液通透20min，PBS洗5min重復3次。

3、 抗原修復：切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中60度水浴30min，自然冷卻，PBS洗5min重復3次（此步驟可選做，修復有助于抗原修復和去除內源性過氧化物酶）。

4、 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

5、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3% BSA（或者其他封閉液）均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、 加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 熒光染料反應：TYRXXX熒光染料反應2-15min，PBS洗三次。

9、 上一輪抗體洗脫：滴加適量37度預熱至完全溶解的抗體洗脫液覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘。

10、 重復2-9步驟（換用另外一種TYRXXX熒光染料）

11、 DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

12、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

13、 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Three-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.